Leonardos Eltern waren der zur Zeit der Geburt Leonardos 25-jährige Notar Piero da Vinci (1427–1504) und die damals 22-jährige Magd Caterina. Mittlerweile vermutet man in ihr eine getaufte arabische Sklavin, die bei Piero vorübergehend als Magd arbeitete. Die Hypothese ist jedoch umstritten und wird kontrovers diskutiert.

Die Mutter heiratete später den Töpfereibesitzer Accattabriga di Piero del Vacca aus Vinci und bekam fünf weitere Kinder. Der Vater Piero war viermal verheiratet und hatte von seinen beiden letzten Frauen neun Söhne und zwei Töchter. Leonardo nahm er als leiblichen Sohn an. Als erfolgreicher Notar gehörte die Familie de’ Medici zu seinen Klienten wie auch Mitglieder der regierenden Signoria, des Rats des Stadtstaates Florenz.

Leonardo, der ab 1457 bei der Familie seines Vater lebte, verbrachte den größten Teil seiner Jugend in Florenz. Schon früh interessierte er sich für Musik, Zeichnen und Modellieren. Durch Vermittlung seines Vaters, mit dem Leonardo nach Florenz umgezogen war, nahm ihn 1469 der Künstler Andrea del Verrocchio (1435–1488), der die künstlerische Begabung des Jungen erkannte, in seine Werkstatt auf.

Leonardo, der im Gegensatz zu vielen seiner Zeitgenossen eine äußerst gepflegte Erscheinung war und sehr auf Sauberkeit achtete (und bereits den Zusammenhang zwischen Pest und Schmutz erkannte), organisierte mit Hilfe von Booten die erste Müllabfuhr in Mailand und trug somit zu einer wesentlichen Verbesserung der Lebensqualität in der Stadt bei.

In den Jahren 1503–1506 arbeitete Leonardo auch intensiv am Porträt der Mona Lisa. Einige Quellen belegen, dass die neapolitanische Hausfrau Monna Lisa del Giocondo (geb. Gherardini), Gattin des Francesco di Bartolommeo di Zanobi del Giocondo, für dieses Bild das Modell saß. In Lisa Gherardini soll er ein Modell gefunden haben, dessen Antlitz und Lächeln einen einzigartigen, rätselhaften Charme besaß.